因此随着对酵母降解精氨酸产生尿素的分子生物学水平的研究，国外研究人员进行了许多减低尿素分泌的
氨酸是通过尿素循环途径实现的ｆ】２。１４】。见图ｌ。
万方数据
董茎全！！蕉：煎塑塑主叁叁里堕刍墼丝墅盛垫堡垦墅堕旦查
代谢途径存有争议。后来，Ｌｉｕ
Ｓ
＿
Ｑｐ，２７１通过研究证明，ＭＬＢ
酵母工程菌的研究。试图通过改变酵母基因以减少尿素的分泌，对降低酒中ＥＣ含量有着巨大的促进作用。ＰＡＲＲ等利用反义干扰技术构建低精氨酸酶活性的葡萄酒酵母菌株【１刀；Ｋｉｔａｍｏｔｏ［１８。１卯等利用同源重组原理敲除２
直至２０世纪９０年代，研究者仍对ＭＬＢ的精氨酸
对精氨酸的降解不是尿素循环途径，而是精氨酸代谢途径，即精氨酸脱亚氨基酶途径（Ａｒｇｉｎｉｎｅ
ｄｅｉｍｉｎａｓｅｐａｔｈ一
个ＣＡＲｌ的等位基因构造精氨酸酶基因缺陷性，获得低
产尿素的清酒酵母菌株，酒液即便经过６个月的贮存，ｗａｙ，简称ＡＤＩ途径），并通过实验检测到了与ＭＬＢ精氨酸代谢有关的３个关键酶：精氨酸脱亚氨基酶（Ａｒｇｉｎｉｎｅ
ｔｒａｎ一
ＥＣ含量也无明显上升。Ｙｏｓｈｉｕｃｈｉ和Ｓｃｈｅｈｌ【凇１等分别利ｄｅｉｍｉｎａｓｅ。ＡＤＩ）、鸟氨酸氨基甲酰转移酶（Ｏｍｉｔｈｉｎｅ
用单细胞融合技术培育不产尿素的清酒和蒸馏酒酵母菌株。Ｄａｈａｂｉｅｈ通过“自克隆技术”．分别过表达酿酒酵母控制降解尿素途径的ＤＵＲｌ，２基因及摄取尿素进入细胞的ＤＬ刀陷基因。构建出相应工程菌并用于日本清酒发酵，结果发现，过表达ＤＵＲｌ，２基因的菌株所发酵生产的清酒中ＥＣ含量能够减少８７％．雨过表达ＤＵＲ３基因的菌株则只能使ＥＣ减少１５％１２３１。２００６年，致力于遗传改
良酵母菌种的生产商——加拿大Ｆｉｒｓｔ
ＶｅｎｔｕｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏ—
ｇｉｅｓ公司宣布成功将脲酶基因转人葡萄酒酵母细胞．这些酵母菌可以使葡萄酒中的氨基甲酸乙酯的含量降低８９％．２００７年ＦＤＡ批准了该公司改造的葡萄酒酵母ＥＣＭ００１菌株投入商业运营。王德良洲等通过Ｈｅ－Ｎｅ激
光和亚硝基胍复合诱变法筛选得到了ｌ株ＣＡＲｌ突变型
低产尿素黄酒酵母菌株，使发酵液中尿素含量下降了５２．１５％。朱旭亚１２５］通过同源重组方式将ＤＵＲｌ，２基因整
合到黄酒酵母基因组中。获得菌株８５哪旧．再将其与出
发菌８５＃进行黄酒酿造实验．结果表明。酒体中尿素和ＥＣ含量分别比出发菌株降低了６９％和４ｌ％。虽然通过以上各种方法构建的菌株在降低氨基甲酸乙酯含量方面取得了一定的成效，但仍然存在一些缺陷，除了不能完全消除发酵酒中的氨基甲酸乙酯外．有的还可能会影响到菌株的发酵速度，而有的利用基因中断法虽然能破坏精氨酸酶基因。但实验中在中断精氨酸酶基因的同时，引入了抗性筛选标记基因，这使得构建的酵母菌株无法在食品工业中得到推广应用。因此。用非抗性筛选标记替代抗性筛选标记来构建精氨酸酶基因缺失的基因工程菌是基因工程菌发展的一个方向．同时在生产中还需要考虑发酵性能的保持、工艺条件的适应性、酒体风格的独特性等方面的表现。
１．２葡萄酒ＭＬＢ的精氨酸脱亚氨基酶途径
葡萄酒酿造中，在酒精发酵结束后。一般要进行苹果酸一乳酸发酵（Ｍａｌｏｌａｃｔｉｃｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ＭＬＦ）。ＭＬＦ是在苹果酸乳酸菌ＭＬＢ的作用下。将双羧基的Ｌ一苹果酸脱
羧基转变成单羧基的Ｌ一乳酸的过程。ＭＬＦ在降低葡萄
酒酸度、改善葡萄酒风味和增加葡萄酒微生物稳定性等方面具有重要意义闭。而ＭＬＢ的精氨酸代谢会导致中间代谢物瓜氨酸的分泌。
万方数据
ｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ。ＯＴＣ）和氨基甲酰激酶（Ｃａｒｂａｍａｔｅ
ｋｉｎａｓｅ，
ＣＫ）ｏ
Ｌ一精氨酸＋Ｈ２０———?Ｌ一瓜氨酸＋Ｎｉｌ３
精氨酸脱亚氨基酶（ＡＤＩ）
Ｌ－瓜氨酸＋Ｐｉ一氨基甲酰磷酸＋Ｌ一鸟氨酸鸟氨酸氨基甲酰转移酶（ＯＴＣ）
氨基甲酰磷酸＋ＡＤＰ—ＡＴＰ＋ＮＨ３＋Ｃ０２
氨基甲酰激酶（ＣＫ）
图２葡萄酒中苹果酸乳酸茵的精氨酸代谢途径
在ＭＬＢ的精氨酸代谢途径中．除了形成氨和鸟氨酸外，还有少量中间代谢物瓜氨酸分泌出来。Ｍｉｒａ
ｄｅ
Ｏｒｄｕｎａ［２ｓ－２９］等研究发现，在一定ｐＨ值下，ＭＬＢ分泌瓜氨酸的量与培养基中精氨酸的初始量存在线性回归关系。目前．瓜氨酸的积累和分泌机制尚不十分清楚，有人认为可能是因为精氨酸由ＡＤＩ水解形成瓜氨酸的速率比ＯＴＣ作用于瓜氨酸形成鸟氨酸和氨基甲酰磷酸的速率快；也有人认为。瓜氨酸分泌可能是因为瓜氨酸合成和分解反应之间能量的解偶联作用。特别是细胞生长到稳定期之后，细胞生长逐渐减慢或停止，而培养基中精氨酸过量，精氨酸降解产生的ＡＴＰ不被细胞利用而积累，因此抑制了ＯＴＣ的活性。因此，经ＡＤＩ途径降解精氨酸的微生物具有形成且分泌瓜氨酸的特点，这对葡萄酒酿造具有重大意义．因为分泌的瓜氨酸可以和乙醇自发反应生成氨基甲酸乙酯。
ＭＬＢ的精氨酸代谢及瓜氨酸分泌具有菌株特异性【ｌｏ刀瑚一，在进行葡萄酒ＭＬＢ降酸时，应选择没有精氨酸代谢或代谢中没有瓜氨酸分泌的菌株。即ＡＤＩ酶活高、ＯＴＣ活力低的菌株不能用于生产，以尽量降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量。李华【３ｌＪ等分离筛选出了我国优良的０．ｏｅｎｉ菌株，但对其进一步研究发现，ＭＬＦ后的
葡萄酒中精氨酸含量仍然很高（６～１０ｍｇ／Ｌ）。法国和阿
根廷已经完成０．ｏｅｎｉ和Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ的ａｒｅ簇基因全序列测序，这将为我国ＭＬＢ的精氨酸代谢研究提供更多的信息【３２】。１．３其他途径
一些葡萄酒生产商发现。在装瓶时检测ＥＣ为阴性，但经过贮藏和运输环节后，酒中的ＥＣ含量超过了
＿
！！塑翌垫！！！！！竺！！塑！璺篁！！！塑！：兰！里旦旦垦二兰垒坠型里兰竺！型竺星壁！呈！坚翌旦兰里里兰！！！！翌！：！！堡！！：！！鱼、
１００“ｇ／Ｌ。Ｍｕｌｌｅｒ＿［３，】等研究发现，葡萄酒酿造中，双乙酰和尿素反应生成的３ａ，６ａ一二甲基甘脲（３ａ，６ａ—ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｏｌｕｒｉｌ．ＤＭＧＵ）也是ＥＣ的前体物质．ＤＭＧＵ和乙醇反应生成ＥＣ主要发生在装瓶后，而且葡萄酒中ＥＣ浓度和ＤＭＧＵ的量有关。因此，双乙酰和尿素反应生成ＤＭＧＵ是葡萄酒中ＥＣ产生的另一条途径。
此外．还有研究表明．尿素与乙醇合成ＥＣ的量与温度有关，随着温度的升高，ＥＣ的生成量增大［３４，３５】。同时，在６０～１００℃的乙醇水溶液中，尿素能被分解为异氰酸盐和氰酸盐，它们分别都能在酸性环境中与乙醇反应生
成ＥＣ［３６～３７
３８］。
ＮＣ０’＋Ｃ２Ｈ５０Ｈ＋Ｈ＋—｝Ｃ２Ｈ５０ＣＯＮＨ２
另外。在蒸馏酒如白兰地的蒸馏过程中，高温会使一部分尿素受热分解生成氰酸，随后生成的氰酸会与酒精反应生成ＥＣｌ３６．３９］。
热分解
＋Ｃ２Ｈ５０Ｈ
２影响葡萄酒中ＥＣ含量的因素
Ｈ２ＮＣＯＮＨ２一ＮＨ３＋ＨＯＣＮ—Ｈ２ＮＣ０２Ｃ２Ｈ５
葡萄酒中ＥＣ的形成主要和葡萄汁中精氨酸浓度有关［４０ｌ。Ｇｕ［４１】和Ｓｏｕｆｌｅｒｏｓ［４２１等研究了葡萄品种中砧木、修剪、灌溉及土壤施肥等对葡萄汁精氨酸浓度及葡萄酒中ＥＣ浓度及潜在浓度的影响，结果表明，葡萄栽培管理方法对葡萄汁中精氨酸浓度有很大影响，尤其重要的是葡萄汁中精氨酸浓度与葡萄酒中ＥＣ含量存在着很大的相关性。２．１施肥
葡萄园的氮肥对葡萄汁中的氮含量有直接的影响。Ｓｐａｙｄ等【４３删研究表明，随着施氮量的增加，葡萄叶柄部的硝基氮含量增加，并且葡萄汁中精氨酸的含量与氮肥施用量成正比，把收获的葡萄酿酒，葡萄酒中的尿素含量也与氮肥施用量呈正比。一般情况下，如果精氨酸含量超过１０００ｍｇ／Ｌ，就可以认为葡萄园地所施氮肥过量。２．２地面覆盖作物
用豆科植物作为地面覆盖作物时，可明显增加葡萄果实中氮的含量。一些豆科作物，如ｖｅｔｃｈｅｓ（Ｖｉｃｈｉａｓｓｐ），ｃｌｏｖｅｒ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍｓｓｐ）和ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍｓｓｐ）等作为葡萄园地面覆盖作物时，会使葡萄藤中氮含量明显增加，而葡萄藤中氮含量与葡萄汁中精氨酸含量有很大的相关性。２．３葡萄品种和砧木
Ｈｕａｎｇｔ４５】等研究了葡萄园位置、葡萄品种及砧木对葡萄汁中氨基酸含量的影响。结果表明，葡萄品种不同，对氮的吸收也不同。低氮品种主要与其植株根系的特性有关，使用不同的砧木，其含氮量会发生变化。Ｇｕｔ４１１等研究发现．不同的砧木品种产生的叶柄硝基氮含量不同，从而
万方数据
会导致葡萄汁中精氨酸含量有所不同。因此，砧木对葡萄园的氮含量和施肥管理有着极其重要的影响。另外，葡萄汁的含氮量与葡萄园的位置、土壤、灌溉、葡萄收获时的天气以及葡萄成熟度等也有关系。
另外，ＥＣ的形成还与葡萄酒酿造时加入的营养剂以及贮藏温度和时间等有关。
２．４葡萄汁营养添加剂
在酒精发酵过程中，因酵母生长繁殖的需要，葡萄汁中应含有一定量的含氮化合物，否则会造成酵母发酵中途终止。研究表明，发酵时加入氮源，如磷酸氢二铵，能明显加快发酵速率，防止发酵“阻滞”㈤。然而，Ｖｉｒｇｉｎｉａｔ４ｎ研究表明．如果添加过量的磷酸氢二铵会导致尿素的形成，并被酵母分泌到葡萄酒中。因此，他认为添加过量的磷酸氢二铵也是导致ＥＣ形成的一个因素。Ｉｎｇｌｉｓｔ４８１研究发现，不同的酵母菌株产生ＥＣ的量与加入磷酸氢二铵的时间有关．有的菌株发酵时加入的时间越早，ＥＣ产生量越少，而有的菌株ＥＣ产生量与磷酸氢二铵的加入时间没有太大关系。
２．５带酒脚陈酿
在白葡萄酒酿造工艺中，为了使葡萄酒风味特征更突出，一般在发酵结束以后带酒脚陈酿。由于酵母的自溶．在贮藏期间含氮化合物会逐渐从细胞中释放出来湖。
据报道．氨基酸含量低的葡萄酿造的葡萄酒，延长与酒泥的接触时间。ＥＣ的含量并没有增加，并且在陈酿期间．也没有其他的ＥＣ前体从酵母中释放【４９】。因此，如果葡萄汁中含氮量低，即使延长酒泥的接触时间，也不会增加ＥＣ的潜在性．反之亦然。ＭａｕｒｉｃｉｏｔＳｏ］等研究表明，在带酒脚陈酿过程中。尿素的积累具有菌株特异性，并和陈酿期间的通氧情况也有关系，如果陈酿期间处于通风状态，尿素被大部分降解，则会减少尿素的积累。２．６发酵与贮藏温度
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